全球首款获批细胞药Amchepry背后的iPSC衍生多巴胺能前体细胞的标准化分化流程

2026/05/26

EastMabBio

2025年，北京天坛医院完成国内首例iPSC衍生多巴胺能神经细胞移植治疗中重度帕金森病的I期注册临床研究。术后患者运动功能、生活质量及开期（药物起效后患者症状明显缓解）时间等核心指标均出现改善，且未观察到严重不良反应。

2026年，由Sumitomo Pharma与Kyoto University合作开发的全球首批iPSC帕金森病细胞疗法 Amchepry 在日本获批上市，标志着iPSC来源神经细胞替代治疗正式进入产业化阶段。

一

为什么多巴胺能神经元是帕金森病治疗的核心？

多巴胺能（DA）神经元是中脑黑质中的关键神经元类型，负责分泌多巴胺并调控运动、认知等行为。当超过50%~70%的DA神经元丢失后，患者会逐渐出现：

静止性震颤
肌强直
运动迟缓
步态障碍

因此多巴胺能神经元退化被认为是帕金森病的核心病理机制之一。

传统药物虽然能够短期补充多巴胺，但无法阻止神经元持续退化。因此，“细胞替代治疗”成为近年来神经再生医学的重要方向。通过体细胞重编程获得的具有多向分化潜能的iPSC，进一步定向诱导形成多巴胺神经前体细胞，经神经外科导航系统，将细胞悬液注射至患者双侧壳核，前体细胞迁移、分化、长出突触，和宿主神经网络整合以恢复多巴胺神经元功能。为帕金森病这种长期缺乏根治手段的神经退行性疾病提供了新的治疗思路。

二

基于Amchepry临床前研究中iPSC衍生DAPs的标准化分化流程

临床前研究概述（图源：Nature Communications）

1. iPSC细胞库的建立（临床级）

细胞来源：白细胞抗原（HLA）纯合的健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）。

重编程方法：使用附加型质粒电穿孔，质粒携带 OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, mp53DD, EBNA1。

培养与克隆筛选：在无饲养层、无血清培养基（StemFit AK03）中培养3周，手动挑选单细胞来源的克隆。通过形态、正常核型、无质粒残留、多能性标志物表达及神经分化效率筛选出最优克隆。

细胞库建立：依次建立初级细胞库（P4）、次级细胞库（P9），最终建立主细胞库（MCB，P12），冻存于液氮。

2. 分化起始及底板诱导（Day 0–Day 12/13）

复苏与预培养：解冻MCB（P12），在Laminin 511 E8 包被的培养皿中用StemFit AK03传代2次后开始分化。

分化铺板：Day 0，将iPSCs解离为单细胞，以 5×10⁶细胞/孔的密度接种于Laminin511 E8包被的6孔板。培养基为分化基础培养基（GMEM + 8% KSR + NEAA + 丙酮酸钠 + β-巯基乙醇），并添加 10 μM Y-27632（ROCK抑制剂）以提高存活率。

小分子诱导（每日换液）：

Day 0–12：持续添加 100 nM LDN193189（TGF-β/BMP信号抑制剂）。
Day 0–6：添加 500 nM A83-01（ALK抑制剂）。
Day 1–6：添加 100 ng/mL FGF8 和 2 μM Purmorphamine（SHH信号激动剂）。
Day 3–12：添加 3 μM CHIR99021（GSK-3β抑制剂，WNT激活剂）。

3. CORIN⁺细胞（中脑底板来源的多巴胺能祖细胞）的分选（Day 12–13）

解离与染色：用TrypLE消化细胞，使用PE标记的抗CORIN抗体（终浓度100 ng/mL）染色20分钟。

流式分选：使用FACSAria III或Influx分选仪，设置阳性门（对照样本阳性率<0.1%），分选 CORIN⁺ 细胞。

4. 聚集体形成与成熟（Day 13–Day 30）

铺板成球：将分选后的CORIN⁺细胞以 2-3×10⁴细胞/孔的密度，铺于96孔板中，使其自然聚集成球。

成熟培养基：神经分化培养基，组成为：Neurobasal + γ射线照射的B27（无维生素A）+ 2 mM L-谷氨酰胺 + 10 ng/mL GDNF + 200 mM 抗坏血酸 + 20 ng/mL BDNF + 400 μM dbcAMP。初始时还加入 30 μM Y-27632 和 80 μg/mL庆大霉素。

培养与换液：每3天半量换液，持续培养至Day 26左右计数细胞球数，用于移植剂量估算。

5. 收获细胞（Day 30）

收集聚集体球（此时为多巴胺能祖细胞，DAPs），用生理盐水清洗4次，置于 5℃ 保存直至移植。

三

多巴胺能前体细胞成熟过程中使用的关键重组蛋白

1. 维持iPSC多能性与未分化状态

bFGF：是一种基础型的生长因子，在iPSC建立的初期，加入StemFit AK03培养基，可以抑制干细胞分化的倾向，维持其多能性核心。

2. 从iPSC分化为多巴胺能祖细胞

FGF-8：Day 1-6，浓度为100 ng/mL。中脑模式化关键因子，诱导中脑-后脑边界（MHB）形成，指定多巴胺能神经元前体区域身份，与SHH协同定义中脑底板特性。

3. 促进神经祖细胞成熟与长期存活

GDNF：Day 13 起添加，浓度为10 ng/mL。多巴胺能神经元存活与轴突生长关键因子，属于TGF-β超家族，通过Ret受体酪氨酸激酶信号通路，促进多巴胺能神经元存活、分化、成熟及突触形成。
BDNF：Day 13 起添加，浓度为20 ng/mL。属于神经营养因子家族（NGF家族），通过TrkB受体促进神经元存活、分化、突触可塑性和成熟，协同GDNF增强多巴胺能表型。

4. 其他重组蛋白

IL-6(50 ng/mL)、SCF(50 ng/mL)、TPO(10 ng/mL)、FLT-3L(20 ng/mL)、IL-3(50 ng/mL)、G-CSF(10 ng/mL)：一组在重编程前扩增外周血单核细胞中的造血祖细胞群体，为后续电转提供充足靶细胞^[2]。
Laminin 511 E8：在整个细胞培养过程中都用于包被培养皿，是一个关键的基质蛋白，能为iPSCs的贴壁和生长提供仿生的细胞外基质支持。

参考文献

1. Sawamoto N, Doi D, Nakanishi E, et al. Phase I/II trial of iPS-cell-derived dopaminergic cells for Parkinson's disease. Nature. 2025;641(8064):971-977.

2. Doi D, Magotani H, Kikuchi T, et al. Pre-clinical study of induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitor cells for Parkinson's disease. Nat Commun. 2020;11(1):3369.

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