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免疫诊断中二抗怎么选？常见问题解答看这里
2025/06/23
二抗（Secondary Antibody）是指能够特异性识别并结合一抗（Primary Antibody）恒定区（Fc 段） 的抗体。在间接法中，一抗负责特异性结合靶标抗原，如病原体抗原、疾病标志物蛋白等，而二抗则通过与一抗结合，携带可检测的报告分子，如酶、荧光基团、生物素等，实现信号的转换、放大与可视化，是免疫诊断信号检测的关键一环。
图：直接法（上）与间接法（下）
二抗通常通过将特定物种来源的免疫球蛋白（作为抗原） 免疫另一种动物来制备。如，若要获得识别小鼠 IgG 的一抗对应的二抗，一般会选择山羊、驴或兔子进行免疫，从而产生抗小鼠 IgG 抗体。
特异性结合
二抗的抗原结合位点（Fab）能够精准识别并结合一抗的 Fc 段，确保信号传递的特异性。
信号生成与放大
二抗的核心功能是将不可见的一抗-抗原结合事件转化为可检测的强信号，并在此过程中实现显著的信号放大。其信号生成与放大主要依赖于以下关键机制：
（1）携带信号报告分子：二抗在制备过程中会被预先连接上能够产生可检测信号的分子。这些分子是信号生成的“源头”。
（2）多价结合能力：大多数用作二抗的免疫球蛋白（如IgG）具有多个抗原结合位点（通常是两个，即二价）。
（3）信号放大的级联效应：将上述两点结合起来，就形成了强大的信号放大链条。
一抗宿主物种匹配性
这是选择二抗的首要原则。必须确保所选二抗是针对一抗宿主物种，如兔、小鼠、山羊、大鼠等特异性设计的，否则会导致二抗无法与一抗有效结合，影响检测结果。
报告分子选择
二抗携带的报告分子类型必须与实验平台和检测方法匹配。
交叉吸附性
在多重标记实验或样本可能含多种物种免疫球蛋白的情况下，如人血清样本，必须使用经过充分交叉吸附处理的二抗。这类二抗通过亲和层析去除了针对其他常见物种免疫球蛋白的交叉反应性，能显著降低非特异性结合背景，提高检测的准确性。
抗体类型
（1）多克隆二抗：多克隆二抗能够识别一抗 Fc 段的多个表位，因此亲和力较高，信号较强，并且对一抗不同亚型，如 IgG1、IgG2a 等兼容性好，适用于多种检测场景。
（2）单克隆二抗：单克隆二抗只识别单一表位，特异性极高，批次间一致性优异，特别适用于要求高度标准化和重复性的定量检测。
片段形式
（1）完整 IgG：这是最常见的二抗形式。
（2）F (ab')₂ 片段：该片段是通过酶切去除 Fc 段的二价片段。其优势在于减少了与样本中 Fc 受体，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞的非特异性结合，从而降低背景，同时分子量较小，可能改善组织穿透性，在免疫组化（IHC）中具有一定优势。
（3）Fab 片段：Fab 片段为单价片段，分子量最小，穿透性最好，但亲和力通常低于完整 IgG 和 F (ab')₂ 片段。
二抗浓度过高，此时需要进行浓度梯度优化，找到合适的二抗使用浓度。
封闭步骤不充分或封闭剂选择不当，例如封闭剂中含有与目标抗原交叉反应的成分，会导致非特异性结合增加，背景升高。
二抗存在非特异性结合，这种情况下应选用经充分交叉吸附的二抗，减少非特异性结合。
洗涤不彻底，可通过增加洗涤次数、时间或强度来改善。
一抗特异性不足或存在交叉反应，影响检测结果的特异性。
样本自身特性，如坏死组织、富含内源性酶 / 生物素的样本，也可能导致背景信号升高。
二抗的最佳工作浓度没有通用标准。需要通过预实验进行梯度稀释测试，一般可从 1:200 至 1:20,000 进行稀释，结合具体一抗、样本类型和检测系统，评估信噪比（Signal-to-Noise Ratio, SNR），选择信号强度合适且背景最低的浓度点。供应商推荐浓度可作为起始参考，但最终仍需通过实验确定。
二抗与一抗物种不匹配，导致二抗无法与一抗结合，从而无信号产生。
二抗浓度过低，不足以产生可检测的信号。
二抗失活，可能是由于储存不当、反复冻融或过期等原因造成。
检测系统问题，如底物失效、显色 / 发光时间不足、荧光淬灭、仪器故障等，都会影响信号的检测。
一抗失效或浓度过低，无法有效结合靶抗原，进而影响二抗信号。
靶抗原表达量过低或抗原表位被遮蔽，使得一抗和二抗难以结合，导致信号微弱或无信号。
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